消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和转化生长因子-α的影响

    摘要：目的 观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和转化生长因子-α（TGF-α）的影响。方法  采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型，以复方鳖甲软肝片为对照，观察消臌软坚丸对大鼠肝脏病理形态学和TGF-α的影响。结果  与正常组比较，模型组大鼠肝间质广泛纤维组织增生，将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团（即假小叶形成），血清和肝组织TGF-α含量明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。与模型组比较，高、低剂量组和对照组肝小叶结构亦受损，少量纤维组织增生，但未见形成间隔。血清和肝组织TGF-α含量明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。结论  消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害，同时可降低血清和肝组织TGF-α水平，具有显著的抗肝脏纤维化，阻断肝硬化进程的作用，对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

    关键词：消臌软坚丸；肝硬化；病理形态学；转化生长因子

    肝硬化是临床常见的慢性进行性肝脏疾病，是由一种或多种病因长期或反复作用造成的弥散性肝脏损害，肝硬化腹水是肝硬化门脉高压征的主要临床表现 。消臌软坚丸是我院治疗肝硬化腹水的制剂，临床研究显示对腹水具有良好效果^［1］。为了进一步阐明其作用机理，本实验采用复合因素造模法复制肝硬化大鼠模型，然后给予药物治疗，以观察消臌软坚丸对肝硬化大鼠肝组织病理学和血清和肝组织转化生长因子-α（TGF-α）的影响，以揭示其延缓肝硬化进程，治疗肝硬化腹水的作用机理。

材 料 与 方 法

    1 材料
   
    1.1 实验动物
健康SD大鼠60只，体重（180±20）g，雌雄各半，由河南安阳华兴实验动物养殖场提供，动物合格证号：SCXK（豫）2004-0007。

    1.2 实验用药 
    消臌软坚丸由河北中医肝病医院制剂室制备（该院自拟方，由黄芪30g、车前子30g、葶苈子15g、沉香6g、鳖甲30g等组成，课题组监制）。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。
    复方鳖甲软肝片（阳性药对照组）：由内蒙古福瑞制药有限责任公司提供，国药准字（2005）Z-71号。实验时用蒸馏水将其配制成所需浓度的混悬液。

 主要试剂
    转化生长因子-α（TGF-α）试剂盒（批号：20051202），购自解放军总医院科技开发中心放免所。

 主要仪器
    722型光栅分光光度计，上海第三分析仪器厂；1-15K型高速冷冻离心机，美国Sigma公司；HH-W21-600型电热恒温水箱，天津泰斯特仪器有限公司；LEICA RM2125型切片机，德国LEICA公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂。

    2 方法
   
    2.1 模型制备

    60只大鼠均适应性喂养1周，随机分为造模组48只和正常组12只。参照文献^[2]， 48只造模组大鼠首次予皮下注射40% 四氯化碳（CCl4）花生油溶液0.5ml /100 g体重，以后每周2次皮下注射0.3ml/100g，共9周。造模开始前2 周均以20% 猪油、0.5%胆固醇、79.5%玉米面混合饲料（由河北医科大学动物实验中心加工）喂养，第 3～9 周以0.5%胆固醇和 99.5% 玉米面混合饲料（由河北医科大学动物实验中心加工）喂养。整个造模期间以 30%乙醇作为饮料让大鼠自由饮用。正常组则以正常饲料和纯净水喂养。实验9周末确认造模成功后予以分组治疗。

    2.2 分组与治疗 

    正常组随机抽取9只大鼠，将造模成功大鼠随机分为4组，每组随机抽取9 只，雌雄各半。给药情况：（1）正常对照组（简称“正常组”）：灌服生理盐水10ml/Kg体重，每日1次；（2）模型对照组（简称“模型组”）： 灌服生理盐水10ml/Kg体重，每日1次；（3）消臌软坚丸低剂量组（简称“低剂量组”，药量相当于临床成人用量的7.5倍）：每日用药剂量为1.6g/Kg体重，每日1次灌胃；（4）消臌软坚丸高剂量组（简称“高剂量组”，药量相当于临床成人用量的15倍）：每日用药剂量为3.2g/Kg体重，每日1次灌胃；（5）阳性药对照组（简称“对照组”）： 用复方鳖甲软肝片的混悬液灌胃。用药剂量为0.6g/Kg体重（药量相当于临床成人用量的15倍），每日1次灌胃，每次用药体积均按1ml/100g体重计算，共4周。

    2.3 标本制备 

    治疗4周末，于最后一次给药禁食12h后用10%水合氯醛（0.2ml/kg）麻醉大鼠，腹部正中切口，腹主动脉取血，立即以4℃ 3500r/min离心5min，分离血清，密封，-20℃冻存待检；大鼠取血后，迅速剖取肝脏，并在肝脏最大叶距边缘约0.5cm处取1cm×1cm×1cm大小组织块，置于4%多聚甲醛溶液固定24h，逐级酒精脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，采用HE染色法，光镜下观察肝硬化大鼠肝组织病理形态学变化；剩余肝组织匀浆，离心提取上清，-20℃冻存待检。分别依据试剂盒要求测定血清和肝组织TGF-α含量。
2.4 统计学处理

    数据采用均数+标准差（x ±s）表示，运用SPSS for windows 11.5统计软件，用方差分析、Student- Newman-Keul检验。显著性差异水平以0.05、0.01为标准。

结    果

    1 各组大鼠病理形态学的变化

    正常组大鼠肝脏柔软，红润，被膜光滑。肝组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞排列规则成索状，在中央静脉周围呈放射状分布。肝血窦结构清晰，无异常改变。肝细胞呈多边形，胞浆均匀，细胞核形态正常。模型组大鼠肝脏体积有所增大，质地变硬，色黯红，切面可见多个小结节。肝小叶正常结构消失，间质内弥漫性淋巴细胞浸润。肝细胞体积明显增大，局部肝细胞出现严重的脂肪变性，可见到再生的肝细胞（双核）。肝间质广泛纤维组织增生，将正常肝小叶分割成大小不等的肝细胞团（即假小叶形成）。高、低剂量组和对照组大鼠肝脏体积、质地、色泽与模型组比较均明显改善，接近正常组。肝小叶结构受损，少数肝细胞气泡样变性但仅偶见坏死细胞，较少炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，但未见形成间隔。

        2 各组大鼠血清和肝组织TGF-α含量变化 见表1。
    与正常组比较，模型组大鼠血清和肝组织TGF-α含量明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，高、低剂量组和对照组血清和肝组织TGF-α含量明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表1  各组大鼠血清和肝组织TGF-α含量变化（pg/ml，x±s）

注:与模型组比较，^△P〈0.05，^△△P〈0.01

讨    论

    肝硬化腹水是临床上常见的危重病证。多由感受湿热疫毒或酒毒虫蛊，复因酒食不节，情志失畅，而致肝脾失调、气滞血瘀、水液停聚，其中尤以脾虚血瘀，水湿内停为要，故消臌软坚丸突出益气健脾，活血利水，方中鳖甲咸寒入肝脾血分，软坚散结，穿山甲咸能软坚，性善走窜，可透达经络直达病所，二者合用共为通络软坚、消癥化积之主药，丹参“专入血分”，泽兰芳香悦脾、疏利悦肝，黄芪益气健脾，“脾健则积自消”，配白术培固中州以制水之中源；葶苈子为肺家气药，宣肺利水，以开水之上源；沉香性温气香，降气平逆，兼纳肾气以理下焦；厚朴苦能下气，辛能散结，温能燥湿，兼理中下二焦之气滞，大腹皮下气宽中，行水消肿；佐以大剂甘淡渗利之品如茯苓皮、车前子、泽泻等以引湿邪外走。

    TGF-α是粘附在细胞膜上的多肽，其高表达最常见于肿瘤系细胞，如肝癌、肺癌、胃癌等多种肿瘤组织中TGF-α都有高度表达。在正常肝组织中仅见TGF-α微量的表达，而肝硬化时TGF-α血清水平是否升高，国内文献报道不一^[3～6]。

    本实验结果表明，伴随着大鼠肝组织病理形态学变化，模型组大鼠血清和肝组织TGF-α含量较正常组有明显的升高，说明了TGF-α作为肝细胞分裂与增殖的促进因子，对于促进肝再生有重要作用^[7，8]。经过用药治疗后，消臌软坚丸高、低剂量组和对照组均能明显降低TGF-α含量。说明，消臌软坚丸能显著改善肝硬化大鼠的肝脏病理组织学损害，具有促进肝脏的修复与再生，抑制胶原纤维合成、沉积，减轻肝损伤的作用，同时通过降低血清和肝组织TGF-α含量发挥抗肝脏纤维化，阻断肝硬化进程的作用，对腹水的产生与消退也产生积极的影响。

参 考 文 献

    1 戚忠玺，耿兰书，贡桂英，等.消臌软坚丸治疗肝炎肝硬化腹水88例的临床观察. 中医杂志，2004，45（5）：347-349
    2 韩德五，马学慧，赵元昌．肝硬化动物模型的研究．山西医药杂志，1979，(4)：1-5．
    3 徐 军,罗南萍,孙文杰,等.肝癌患者血清转化生长因子α检测的临床意义.中国肿瘤临床,2000;27(3):196~197
    4 刘东屏,刘峥艳,郑有贵,等.肝硬化合并原发性肝癌血清转化生长因子-α测定及临床意义.中国医科大学学报,2000;2(2):125,142
    5 叶晓光,罗润齐.各型肝病患者外周血转化生长因子-α水平及其临床意义.现代临床医学生物工程学杂志,1999;5(4):269~270
    6李根武 伍灵达血清转化生长因子-α的测定对肝硬化及其恶变的价值.中国现代医学杂志，11（7）：47，53
    7杨牧祥，张一昕，王少贤，等.柔肝消癥饮对肝硬化大鼠血清和肝组织IL-1β、IL-6和TNF-α的影响，中华中医药杂志，2007，22（10）：729-731
    8 孙自勤，王要军.转化生长因子α及β与肝细胞再生不能有效发挥肝再生作用.临床肝病杂志，1999，11(1):49